Формы, усвоение и влияние азота
Усвояемый дрожжами азот или YAN — это сочетание свободного аминоазота (FAN), аммиака (NH3) и аммония (NH4+), доступное для дрожжей, например винных дрожжей Saccharomyces cerevisiae во время брожения. Помимо сбраживаемых сахаров глюкозы и фруктозы, азот является самым важным питательным веществом, необходимым для успешного брожения, которое не заканчивается до достижения желаемой степени сухости или появления посторонних запахов и связанных с ними дефектов вина. Поэтому виноделы часто дополняют ресурсы YAN азотными добавками, такими как диаммонийфосфат (DAP).
Однако добавление чрезмерного количества азота также может представлять опасность, поскольку питательные вещества могут использовать не только полезные винные дрожжи, но и другие организмы. К ним относятся микроорганизмы, вызывающие порчу, такие как Brettanomyces, Acetobacter и молочнокислые бактерии из Lactobacillus и Pediococcus родов. Вот почему многие винодельни измеряют YAN после сбора урожая и давления винограда с помощью одного из нескольких доступных сегодня методов, включая анализ азота с помощью о-фталевого альдегида (NOPA), который требует использования спектрометра или метода титрования формалином. Зная YAN в сусле, виноделы могут рассчитать необходимое количество добавок для завершения брожения, создав условия “голода” для любых микроорганизмов, которые могут появиться впоследствии.
Компоненты
YAN — это показатель содержания первичных органических (свободных аминокислот) и неорганических (аммиака и аммония) источников азота, которые могут быть усвоены S. cerevisiae. В сусле и вине содержится несколько азотистых соединений, включая пептиды, более крупные белки, амиды, биогенные амины, пиридины, пурины и нуклеиновые кислоты, но дрожжи не могут напрямую использовать их для метаболизма. В совокупности общее содержание азота в виноградном сусле может составлять от 60 до 2400 мг азота на литр, однако не весь этот азот будет усваиваться. Отсутствие ферментов протеаз, которые расщепляют более крупные пептиды на более мелкие компоненты, способные работать вне клетки, ограничивает размер молекул, которые дрожжи могут использовать в качестве источника азота.
Количество YAN, которое виноделы обнаружат в сусле из своего винограда, зависит от ряда факторов, включая сорт винограда, подвой, почву на винограднике и методы виноградарства (например, использование удобрений и формирование кроны), а также климатические условия конкретного урожая. Поражение плесенью, такой как Botrytis cinerea (известной как благородная гниль, если она желательна), может снизить содержание аминокислот в виноградном сусле на целых 61%. Некоторые регионы известны низким содержанием YAN, например, штат Вашингтон, где во время типичного сбора урожая 90% протестированного сусла содержит менее 400 мг/л, а почти четверть — менее 150 мг/л.
На винограднике азот поглощается виноградной лозой в виде нитрата (NO3−), аммония или мочевины, которые восстанавливаются до аммиака. В ходе дополнительных реакций азот включается в состав глутамина и глутамата и в конечном итоге используется для синтеза других аминокислот и азотистых соединений. После сбора урожая большая часть (около 80%) доступных азотистых соединений, содержащихся в винограде, концентрируется в кожуре и косточках. Эти соединения попадают в сусло в процессе давления и при мацерации/контакте с кожицей. Даже после отжима до 80% первоначального содержания азота в каждой виноградной ягоде остаётся в мезге.
Аминокислоты
Из свободных аминокислот азота (FAN), входящих в состав YAN, наиболее распространены аминокислоты аргинин, пролин и глутамин, за которыми следуют аланин, треонин, серин и аспарагиновая кислота в гораздо меньших концентрациях, хотя в виноградном сусле можно обнаружить следы большинства известных аминокислот. Пролин обычно содержится в наибольшем количестве и может составлять до 30% от общего количества аминокислот. Точное количество FAN варьируется и может составлять от 22 до 1242 мг азота на литр YAN, получаемого из свободных аминокислот.
В то время как аргинин, глутамин и другие аминокислоты быстро расходуются, часто на самых ранних стадиях брожения, пролин вообще не расходуется дрожжами в нормальных анаэробных условиях брожения. Это связано с тем, что один из ферментов, необходимых для его использования, является оксидазой (требующей молекулярного кислорода), а другой подавляется присутствием аммония (другого источника усваиваемого азота, необходимого дрожжам) в сусле. Однако в хорошо аэрируемых заквасках, содержащих сусло, в которое не добавляли фосфат диаммония, обычно наблюдается некоторое использование пролина до того, как вступят в силу анаэробные условия брожения. Когда виноделы измеряют показатель FAN, им нужно знать, включает ли их анализ пролин, поскольку это повысит показатель YAN. Шардоне и Каберне Совиньон — это два сорта Vitis vinifera, которые, как известно, имеют очень высокий уровень пролина, в то время как Рислинг и Совиньон Блан обычно имеют очень низкий уровень.
Дрожжи переносят аминокислоты и небольшие пептиды (менее 5 аминокислотных остатков) в клетку посредством активного транспорта, который использует специализированные мембранные белки и разницу в pH градиента кислого винного раствора (pH от 3 до 4) и почти нейтрального pH цитоплазмы внутри дрожжевых клеток. Белки симпорта протонов в мембране поглощают аминокислоту вместе с ионом водорода, который затем выводится из клетки с помощью насоса для ионов водорода. Это энергозатратный процесс, который становится более энергетически невыгодным для дрожжевой клетки по мере развития брожения и повышения уровня этанола, что приводит к «пассивной утечке» избыточных ионов водорода в клетку. Насосам, перекачивающим ионы водорода, приходится работать ещё интенсивнее, чтобы поддерживать внутренний pH, поэтому они посылают сигнал белкам-симпортерам прекратить перенос других ионов. Это одна из причин, почему добавление азота на поздних стадиях брожения практически неэффективна, так как механизмы переноса азота в клетку отключаются.
Соединения аммиака
На протяжении всего процесса брожения аммиак является основной формой усвояемого дрожжами азота. Однако при прессовании в соке может содержаться от 0 до 150 мг/л солей аммония, в зависимости от того, сколько азота получила виноградная лоза на винограднике.
В клетке неорганические ионы аммония и аммонийные ионы «фиксируются» в результате ряда химических реакций, в результате которых в конечном итоге образуется органический источник азота — глутамат. Ион аммония также служит аллостерическим регулятором для одного из ферментов, используемых в гликолизе, и может влиять на то, как дрожжевая клетка транспортирует глюкозу и фруктозу в клетку. Было показано, что белки, используемые в основной системе транспортировки глюкозы, имеют период полураспада 12 часов. В исследованиях, в которых дрожжевые клетки подвергались «аммиачному голоданию», вся система отключалась через 50 часов, что является убедительным доказательством того, что недостаток аммиака/аммония может повысить риск остановки ферментации.
Глутатион (GSH: L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин) присутствует в клетках дрожжей в высоких концентрациях — до 10 μмоль. Он играет ключевую роль в реакции на нехватку серы и азота.
Аммиак не используется такими бактериями, как Acetobacter и молочнокислыми бактериями, используемыми при молочнокислом брожении.
Важность в виноделии
Усвояемый азот — это важнейшее питательное вещество, необходимое винным дрожжам для полного завершения брожения с минимальным количеством нежелательных побочных продуктов (таких как соединения, подобные сероводороду, которые могут вызывать неприятный запах). В процессе брожения дрожжи могут использовать до 1000 мг/л аминокислот, хотя зачастую требуется гораздо меньше. Дрожжи могут накапливать аминокислоты во внутриклеточных вакуолях, а затем либо использовать их напрямую, встраивая в белки, либо расщеплять и использовать их углеродные и азотные компоненты по отдельности.
В отсутствие азота дрожжи начнут погибать. Некоторые штаммы начнут расщеплять серосодержащие аминокислоты, такие как цистеин и метионин, высвобождая атом серы, который может соединяться с водородом, образуя сероводород (H2S), придающий вину запах тухлых яиц. Однако прямой зависимости между уровнем YAN и выработкой сероводорода нет, поскольку H2S может вырабатываться дрожжами даже при избытке азота, но при недостатке других жизненно важных питательных веществ (например пантотеновой кислоты). Есть даже некоторые штаммы S. cerevisiae, которые вырабатывают H2S в ответ на избыток доступного азота (в частности, на избыток глутаминовой кислоты и аланина). Вот почему профилактический подход, заключающийся в безоговорочном добавлении азота при каждой ферментации, может не дать желаемых результатов в предотвращении образования H2S.
Уровень азота в вине может влиять на многие органолептические характеристики готового вина, в том числе на синтез многих ароматических соединений. Фруктовые спирты образуются в результате расщепления аминокислот, хотя при высоком уровне аммиака и мочевины их выработка снижается. При ограниченном количестве доступного азота повышается уровень глицерина и трегалозы, которые могут влиять на осязательные ощущения.
Необходимое количество
Необходимое количество YAN будет зависеть от целей винодела в отношении ферментации, в частности от того, требуется ли спонтанная ферментация или вино будет полностью сброжено до сухого состояния. Состояние винограда и условия ферментации будут влиять на необходимое количество азота. Поврежденные, заплесневелые или зараженные ботритисом плоды обычно содержат меньше азота (а также других витаминов), чем чистые, неповрежденные ягоды. Это истощение может быть усугублено чрезмерным осветлением сусла и высоким содержанием сахара. Вина, ферментируемые при более высоких температурах, как правило, созревают быстрее, требуя больше азота, чем вина, ферментируемые при более низких температурах в течение более длительного времени. Кроме того, количество кислорода влияет на скорость поглощения азота дрожжами, при этом винам, ферментируемым в полностью анаэробных условиях (например, многим белым винам в резервуарах из нержавеющей стали), требуется меньше азота, чем винам, ферментируемым в бочках или ферментерах с открытым верхом.
Рекомендуемый энологами диапазон варьируется от 150 до 400 мг/л YAN на литр. Некоторые исследования показали, что максимальная скорость брожения может быть достигнута при содержании YAN от 400 до 500 мг/л. Однако не все виноделы хотят, чтобы брожение проходило с максимальной скоростью (с точки зрения биомассы дрожжей, температуры и скорости) из-за влияния, которое это может оказать на другие органолептические характеристики вина, такие как развитие аромата и сохранение фруктовых оттенков.
Исследование, проведённое Департаментом виноградарства и энологии Калифорнийского университета в Дэвисе, показало, что рекомендации по оптимальному уровню азота для завершения успешной ферментации могут быть составлены на основе уровня содержания сахара в соке при сборе урожая, которые были приняты многими производителями дрожжей и питательных веществ.
- 21°Bx = 200 мг/л
- 23°Bx = 250 мг/л
- 25°Bx = 300 мг/л
- 27°Bx = 350 мг/л
Однако другие исследования показали, что успешное брожение может происходить при уровне YAN ниже этих рекомендаций, а также при вялом/затянувшемся брожении, даже если уровень YAN соответствует рекомендациям.
При яблочно-молочном брожении
Как и дрожжам, молочнокислым бактериям (МКБ), используемым при яблочно-молочном брожении (как правило, Oenococcus oeni), требуется азот. Однако, в отличие от S. cerevisiae, МКБ не могут использовать аммиак, и такие добавки, как диаммонийфосфат (DAP), не приносят никакой пользы с точки зрения питания. Виноделы, которые случайно используют DAP в качестве питательной добавки для инокуляции при яблочно-молочном брожении, рискуют вместо этого обеспечить питательными веществами микроорганизмы, вызывающие порчу, такие как Brettanomyces.
В то время как некоторые виноделы подкармливают сусло сухими питательными веществами, содержащими азот, большая часть питательных веществ, необходимых для MLF (Malolactic fermentation – яблочно-молочная ферментация), поступает в результате расщепления (или автолиза) мёртвых дрожжевых клеток. Кроме того, большинство бактерий, используемых в MLF, способны вырабатывать внеклеточные ферменты протеазы, которые также могут расщеплять более крупные пептидные цепи на основные аминокислотные остатки, которые затем могут использоваться для метаболизма.
Измерения и тесты
Анализ азота с помощью о-фтальдегида (NOPA) используется для измерения содержания доступных первичных аминокислот в виноградном соке с помощью спектрофотометра, который может измерять при длине волны 335 нм. Поскольку анализ измеряет только содержание первичных аминокислот, результаты не включают концентрацию пролина или аммиака. Пролин можно измерить отдельно с помощью анализа, в котором нигрин вступает в реакцию с аминокислотой в присутствии муравьиной кислоты, образуя соединение, которое поглощает свет при длине волны 517 нм.
Уровень YAN можно измерить с помощью анализа NOPA (азотно-о-фталдиальдегидный анализ) и спектрофотометра.
Формольное титрование, изобретённое датским химиком Сёреном Петером Лаурице Сёренсеном в 1907 году, использует формальдегид в присутствии гидроксида калия или гидроксида натрия для измерения концентрации аминокислот и аммиака с помощью pH-метра. Реагенты также вступают в реакцию с пролином, что может привести к немного более высокому показателю YAN, чем NOPA. Формальный метод также имеет недостатки, связанные с использованием и утилизацией формальдегида, который является известным канцерогеном и высокотоксичного реагента хлорида бария.
Аммиак и аммоний можно измерить с помощью ионно-селективного электрода и pH-метра.
Азотная добавка
Виноделы давно знают, что некоторые процессы брожения протекают более предсказуемо и «здорово», если в партию добавить мезгу (плотную кожицу, семена и остатки, оставшиеся после отжима) из другой партии вина. Этот метод до сих пор используется для производства итальянского вина Рипассо. В XIV веке в Тоскане техника говерно, использовавшаяся при производстве некоторых из самых ранних сортов Кьянти, включала добавление в партию сушёного винограда. Хотя оба метода также добавляли сахар, они обеспечивали дополнительное количество азота и других питательных веществ, которые оставались в кожуре и семенах.
Мочевина
По мере того как энологи начали лучше понимать науку о брожении, азот был признан основным питательным веществом, и виноделы ещё в 1900-х годах начали добавлять соли аммония в сусло. Мочевина также использовалась в качестве ранней азотной добавки, но исследования, связывающие её с образованием этил-карбамата, привели к её запрету во многих странах, включая Соединённые Штаты, с 1990 года.
Виноделы могут использовать множество видов азотных добавок. Большинство из них представляют собой комплексные составы, включающие азот (из аминокислот или солей аммония) вместе с витаминами, минералами и другими факторами роста и продающиеся под такими торговыми марками, как Go-Ferm, Superfood, Fermaid K (последние две также содержат некоторое количество DAP). Аминокислоты можно добавлять непосредственно в сусло, хотя с 2010 года в том же США разрешено добавлять в сусло только глицин. Например Fermaid-O — это азотная добавка, содержащая дрожжевые оболочки (источник аминокислот) и другие витамины, но не содержащая фосфат диаммония. Дрожжевые оболочки (или дрожжевые «призраки») — это остатки клеточных стенок дрожжей, которые остаются после коммерческого производства штаммов дрожжей, используемых для инокуляции. Помимо того, что они являются источником усвояемого азота из аминокислот, они также содержат липиды и стероиды, которые могут использоваться клетками для укрепления их плазматической мембраны, что позволяет усваивать другие источники азота.
Риск слишком большого добавления
Азотные добавки, в частности DAP, стимулируют размножение дрожжей и могут значительно увеличить биомассу. Это может привести к ускорению процесса брожения, что не всегда желательно для винодела, а также к повышению температуры брожения из-за тепла, выделяемого дрожжами. Избыток биомассы также может привести к дефициту других питательных веществ для дрожжей, таких как витамины и стеролы, из-за усиления конкуренции и может привести к появлению посторонних запахов (например, сероводорода) и даже к остановке брожения.
Повышенное содержание аминокислоты аргинина (более 400 мг/л), особенно в конце ферментации, может привести к увеличению выработки этилкарбамата. Это связано с тем, что аргинин расщепляется до мочевины, которая может быть повторно поглощена и использована дрожжами или преобразована в аммиак. Однако мочевина также вступает в реакцию с этанолом, если она не полностью преобразована, что в сочетании с длительным воздействием (а также высокими температурами) может привести к выработке эфира этилкарбамата.
Однако самый большой риск при чрезмерном добавлении в сусло заключается в том, что после завершения брожения останется избыток азота и других питательных веществ. Это может привести к микробной нестабильности, поскольку микроорганизмы, вызывающие порчу, могут использовать эти избыточные питательные вещества.
Brettanomyces — это один из видов микроорганизмов, вызывающих порчу, который может использовать в своих интересах избыток азота, оставшийся в вине.
Brettanomyces
Сроки добавления
Поскольку большинство питательных добавок питают все живые микроорганизмы в сусле (независимо от того, желательны они или нет), виноделы часто не добавляют питательные вещества до тех пор, пока не будут готовы засеять сусло желаемым штаммом S. cerevisiae. Производители, использующие дикие дрожжи, также могут подождать, пока добавление диоксида серы не уничтожит нежелательные микроорганизмы, или добавить питательные вещества раньше, потому что они хотят, чтобы другие микроорганизмы придали вину дополнительную сложность. При добавлении азот обычно находится в форме аминокислот в сочетании с витаминами и минералами, которые помогают запустить процесс брожения.
Когда дрожжевой стартер регидратируется, соли аммония в DAP становятся слишком токсичными, поэтому виноделы часто используют питательную добавку, которая содержит в основном аминокислоты в качестве источника азота.
Вскоре после инокуляции дрожжи начинают быстро потреблять доступный усваиваемый азот, и к началу полного брожения до 46% YAN полностью расходуется. Поскольку неорганический азот, такой как соли аммония в DAP, в больших количествах токсичен для дрожжей, его никогда не добавляют во время инокуляции, когда биомасса только что регидратированных дрожжей невелика. Многие виноделы разделяют дозировку DAP на две части, добавляя первую в конце лаг-фазы, когда дрожжи вступают в период экспоненциального роста и начинается спиртовое брожение. В большинстве случаев это происходит через 48–72 часа после внесения дрожжей. Вторую дозу часто добавляют примерно на третьей стадии брожения сахара и часто до того, как уровень сахара достигнет 12-10 градусов по Брикс (от 6,5 до 5,5 по Бауме, от 48,3 до 40,0 по Эксле), потому что по мере брожения дрожжевые клетки больше не могут переносить азот в клетку из-за растущей токсичности этанола, окружающего клетки. В результате азот остаётся неиспользованным и доступным для микроорганизмов, которые могут появиться позже.
