Выделение и изоляция ДНК дрожжей в домашних условиях

Выделение ДНК в современном научном мире является довольно простой задачей. Но как это сделать правильно в домашних условиях описано мало. Цель эксперимента – выделение ДНК дрожжей с изоляцией. Получение генетического материала  от дрожжей с известными свойствами, с последующей доставкой его в живую клетку другого штамма и тестирование нового рандомного штамма.
Эксперимент не претендует на уникальность, так как способ описан достаточно подробно, ничего нового не изобретено.
На данный момент закон не запрещает нам выделять и модифицировать клетки дрожжей и она не относится к теме генома человека.  Прошу не переживать противников генной модификации, тут будут только дрожжи.

Аннотация:
Дрожжи являются самым универсальным живым организмом для разработки и тестирования различных ДНК технологий, так как это один из немногих организмов выживающий после серьезного повреждения ДНК, но меняющий свои свойства от полезных, до бесполезных и иногда даже вредных.  В нашем случае дрожжи являются самым интересным организмом, так как они напрямую связаны с нашим хобби и каждый из нас может провести подобный эксперимент, возможно даже с детьми или внуками, что способствует интересу детей к естественным наукам, а нам может послужить новым источником уникальных штаммов. Особенно это касается дистиллятов и пива.  Эксперимент не претендует на уникальность, но будет снабжен простыми объяснениями процессов, часть которых можно упустить.

Немного теории:
Прежде всего необходимо обеспечить относительную чистоту посуды, так как при попадании чужеродной органики (например вашего эпителия) вместо ДНК дрожжей выделится смесь вашей ДНК и дрожжей и на выходе получится микс разных ДНК, которые мы не сможем отделить друг от друга в домашних условиях.
Для выделения ДНК нужно разрушить мембрану клетки и мембрану ядра, митохондрии и вообще целый набор компартментов клетки.  Клетка состоит из разных “отсеков” или “комнат” где работают разные органеллы и все эти “рабочие станции” нужно лишить “стен”. Если короче – разрушить.  Процедура разрушения клетки на самом деле проста, но существуют ограничения заложенные в них природой.  Дело в том, что при агрессивном химическом разрушении можно уничтожить или повредить ДНК, а нам нужно извлечь ее в целом здоровом виде,  а не сегментами.  Хотя, сегменты там все равно будут, но большая часть ДНК будет целой.  Естественный ph клетки 7.2-7.5  и при помещении ее в раствор с более щелочным ph 8.5, то есть отличной от естественной концентрацией ионов H+, получится градиент концентрации ионов и вода из клетки начинает диффундировать в раствор. Для разрушения клетки применяется лаурилсульфат натрия, содержащийся практически во всех моющих средствах.  Лаурилсульфат является  амфифильным веществом способным взаимодействовать как с гидрофильными, так и с гидрофобными молекулами. Клеточные мембраны представляют собой бислой фосфолипидов, один конец которых гидрофобный другой гидрофильный, как раз под действием лаурилсульфата бислой и разрушается.   В лизосомах клетки есть ферменты-гидролазы, способные активироваться при повреждении мембраны, но процесс это длительный и требует дополнительного оборудования типа центрифуги или ультразвуковой ванны. Потому, для ускорения процесса разрушения клетки и освобождения ДНК, желательно применить дополнительные ферменты протеазы.  В виду того, что в лаборатории процедура производится с помощью оборудования, то в нашем случае процесс немного упрощается, что не делает его менее эффективным.

Материалы:

Буферный раствор для разрушения клеток:
1 Вода дистиллированная, можно из осмоса или просто кипяченая, 100-130 мл. Можно и меньше, но так удобней работать.
2 Гидрокарбонат натрия (сода пищевая) – 5 граммов
3 Хлористый натрий (соль обыкновенная) -1.5 граммов
4 Средство моющее типа фейри – 5мл.
5 Индикатор ph или ph метр для контроля буферного раствора.

Раствор протеазы:
Применяются таблетки пищеварительных ферментов, например панкеатин, фестал, мезим. Потребуется 1-2 таблетки и совсем немного воды, таблетки давятся и растворяются.

Спирт этиловый:
В принципе достаточно и 70% спирта, но лучше использовать 96% или выше. Спирт можно высушить прокаленным сульфатом меди (медный купорос). Но это не обязательно.  Спирт необходимо сильно охладить в морозилке.

Также потребуются емкости, любые и чистые.  Предварительно ополоснуть спиртом.

Практика:
Решил выделить ДНК из "саф левюр", но предварительно разбродил эти дрожжи на паточном пастеризованном растворе, за ночь они скушали весь сахар и выпали в осадок.  Попутно прокалил немного медного купороса, подождал когда он остынет и всыпал в 50 мл спирта 94%. Был только такой и виноградный, весь остальной спирт в напитках.  Оба эти шага совершенно не обязательны, это просто мой эксперимент.  В итоге на следующий день утром всыпал в спирт еще порцию прокаленного купороса, а дрожжи уже выпали в осадок. Слил с них раствор, так как они плотно легли на дно и немного промыл чистой водой.  Спирт слил в пузырек и отправил в морозилку.
Фотографии не группированы, просто все как есть…

Приготовил буферный раствор из воды, фейри, соды и соли. Буферный раствор необходимо проверить на ph он должен стать 8.5, в любом случае надо довести этот уровень добавлением соды или воды…  Также приготовил раствор ферментов и отлил немного осадка дрожжей в чистую пробирку.

Взял буферный раствор в количестве 10 мл и добавил его к дрожжевому осадку, после чего поместил в стакан с теплой водой температурой 38℃ и перемешивал 2 минуты.  Обращаю внимание, что температура раствора должна составлять 36-38℃ … после перемешивания нужно внести небольшое количество раствора фермента (2.5мл) и не прекращая перемешивание термостатировать емкость минимум 10 минут, лучше 15.  То есть, аккуратно подливая кипяток в стакан и перемешивая держать температуру.  Нужно добиться работы ферментов, а они работают только при температуре 36-38℃.  В идеале это 37℃.
Таким образом, получается раствор с разорванными клетками и большим количеством ДНК в целом виде.  Чем больше сырья на этом этапе, тем большее количество ДНК можно получить в итоге. 

После этого наступает момент истины. Раствор желательно конечно охладить градусов до 15℃, можно просто облить холодной водой, можно положить пробирку на лед. Просто холод ускоряет процесс осаждения ДНК и если делать это при комнатной температуре, то процесс просто затянется.   
В пробирку (или другую емкость, где находится генетический бульон) с раствором, нужно добавить холодный спирт. Делать это нужно аккуратно, как бармен в баре, но еще аккуратней.  Удобно наклонить пробирку на 45 градусов и медленно шприцем по стенке добавлять спит.  Необходимо добиться равномерного градиента и не смешать раствор вместе.
Данный способ называется спиртовой преципитацией (англ. Ethanol precipitation) -метод, используемый для очищения и концентрации ДНК. Молекула ДНК является полярной (так как несет отрицательный заряд из-за фосфатных групп) и легко растворяется в полярной воде. Основываясь на принципе растворимости в подобном, ДНК нерастворима в неполярном этаноле, и даже в смеси этанола с водой из-за уменьшения количества доступных молекул воды.

Сразу признаюсь, что первый мой эксперимент был провален, ничего не получилось и никакой ДНК я не увидел.  Но позже понял, что к процессу ферментации надо отнестись серьезней (кстати рекомендую в качестве ферментов "фестал"), поддерживать правильную температуру, тщательно все перемешивать, а спирт наливать очень аккуратно.    Также не нужно спешить, после того как спирт будет добавлен к раствору, сразу ничего не произойдет и нужно подождать, просто поставив пробирку в прохладное место на полчасика, может даже и час придется подождать и даже немного постучать по ней.  И если все будет сделано правильно, в итоге на границе спирта и раствора выплывет клубок нитей ДНК..   выглядит он как спутавшиеся волокна ткани (как тополиный пух) и будет висеть на границе спирта и раствора. Нужно взять пипетку и аккуратно его собрать, поместив в отдельную емкость и добавив немного свежего спирта не втянувшего в себя воды из раствора. 

Эксперимент удался, нужно только еще немного подождать и ДНК изолируется лучше…

Результат:
Нерастворимые конгломераты ДНК в растворе спирта, это не одна ДНК отдельной клетки, а несколько миллионов единиц ДНК одного типа из одного штамма дрожжей.  Часть их повреждена, так как использовались хотя и “мягкие” способы изоляции, но довольно агрессивные по отношению к клеткам растворы.

Период полураспада ДНК 512 лет, но года полтора они могут постоять просто в холодильнике, лет 15-20 могут храниться в простой морозилке, а в настоящей криокамере почти вечно.

Генетический материал получен и будет использован в следующем эксперименте по доставке его в клетки другого штамма для получения новой генной модификации дрожжей и наблюдения за результатом. Этот способ выделения ДНК одинаково подходит и для человеческих клеток и клеток любого растения. Также, в сети можно найти готовые наборы для выделения ДНК, но они дорогие и самый дешёвый стоит 3000 рублей на 10 проб и не снабжается этанолом, так как является лабораторным.
Вот так выглядит комок дезоксирибонуклеиновой кислоты из дрожжей в количестве нескольких миллионов единиц.
https://youtu.be/SdTTtewc-9k